Mi experiencia electrofisiológica con ‘Xenopus laevis’

Hace cincuenta y tres años (1958), el equipo de investigación conformado por A. Hodgkin y A. Huxley, de la Universidad de Cambridge (UK), publicó una técnica de registro de cambios eléctricos de membrana en células animales. Quince años de trabajo en nervios ciáticos de rana y axones gigantes de calamar, y doce años interrumpidos por la segunda guerra mundial; dieron a luz a este descubrimiento revolucionario que impulsó el avance de la electrofisiología y de la biología de canales iónicos de membrana. Este avance no vino solo: Hodgkin y Huxley desarrollaron el concepto de los potenciales de acción, y J.C. Eccles desarrolló el concepto de la sinapsis en neuronas. Juntos compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1963. Una década después, el Dr. Erwin Neher del Max-Planck Institute for Biophysical Chemistry de Alemania y su equipo, desarrollaron la técnica Patch Clamp, y por ello obtuvo el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1991.

De izquierda a derecha: Alan Hodgkin, Andrew Huxely, John C. Eccles y Erwin Neher.

Mi intención no es aburriros con ecuaciones de Nerst u otros cálculos biofísicos, sino que os voy a intentar explicar cómo se llega desde la idea de que tu gen produce una posible proteína transportadora, hasta obtener el resultado de si realmente lo es o no.

Mi experiencia en este tema es bastante humilde debido a que aún sigo aprendiendo poquito a poco de los profesionales expertos en esta materia, y todavía me queda mucho camino por recorrer. En abril del 2008 tuve la inmensa suerte de ir a Göttingen (Alemania) con la beca XLAB, que obtuve gracias a que el Dr. Guillermo Álvarez de Toledo Naranjo, profesor e investigador del Dpto. de Fisiología Médica y Biofísica de la Facultad de Medicina de la U.S., formalizó un convenio con el Göttinger Experimentallabor für Junge Leute (Laboratorios experimentales para gente joven “XLAB”) y la U.S., y tras una entrevista en inglés me escogieron junto a 14 compañeros más para vivir esta experiencia “electrofisiológica”. Este laboratorio, cuyas riendas las lleva la Prof. Dra. Eva-Maria Neher (esposa de Erwin Neher), cuenta con grandes profesionales docentes e investigadores en el campo de la electrofisiología, como el Dr. Michael Ferber y la Dra. Barbara Ritter, que nos enseñaron todo lo que había que saber sobre neurofisiología para principiantes. También tuvimos la suerte de recibir un seminario del premio Nobel Erwin Neher en el Max-Planck Institute, y de otros grandes profesionales.

Año y medio después, me hallo haciendo la tesis doctoral en biotecnología de plantas, en el Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología (CSIC) a cargo del Dr. Jose Manuel Colmenero Flores.

Curiosamente, la tesis me vuelve a conducir al campo de la electrofisiología, para caracterizar unos cotransportadores de plantas. De esta forma realicé una increíble y apasionante esEquipo de investigación del Dr. Omar Pantoja, con éste a la izquierda del todo.tancia de mes y medio en Cuernavaca (México), en el Instituto de Biotecnología de la Universidad Autónoma de México (IBT-UNAM), a cargo de Dr. Omar Homero Pantoja, del cual puedo decir que he aprendido muchísimo y estoy muy agradecido por su increíble hospitalidad, y la de todo su inmejorable equipo investigador.

Predicción de la proteína en estudio

Electrofisiológica árbol evolutivoNormalmente, se trabaja con genes poco caracterizados, de los que se intuye su función tras realizar comparaciones de su secuencia conocida de aminoácidos, con bases de datos de proteínas de múltiples organismos. Las secuencias con mayor homología se representan formando un árbol filogenético que se construye por parentesco. Si de este árbol se han caracterizado algunos genes específicos homólogos (en la misma especie) u ortólogos al nuestro (en otras especies), y se conoce su función específica, esto nos puede dar una idea de qué tipo de proteína produce mi gen de estudio, dónde se encuentra, y qué hace o qué sustrato transporta. En estos programas y servidores gratuitos, como el ExPASy o el Protein Data Bank, podemos obtener predicciones de nuestra secuencia, y así saber si puede ser una proteína de membrana, si tiene péptidos señal específico de algún orgánulo, y qué tipo de conformación puede tener.Leyenda

Este campo de la bioinformática es bastante complejo para mí y todavía no lo domino como para explicarlo en profundidad, pero es imprescindible y habrá que desarrollarlo en nuestra revista más adelante.

Obtención del cRNA

Obtención del cRNAPara poder continuar, hay que realizar una transcripción in vitro, de nuestras secuencias de cDNA. Este proceso se lleva a cabo con kits comerciales, como el Kit de transcripción in vitro de AMBION. El RNA es muy sensible a las RNAasas que se encuentran en la saliva, en la piel, y en casi todas partes; así que para realizar este proceso hay que ser muy pulcro, y seguramente este proceso requiera 3-4 fases de purificación para conseguir la cantidad suficiente, y suficientemente purificada para poder trabajar sin problemas. Todo esto se comprueba con análisis en geles de electroforesis. La cantidad y el grado de contaminación de las muestras, se mide en el nanodrop, que es un espectrofotómetro que mide la cantidad de cRNA que hay en una gotita de 1μL (en el esquema aparece reflejada la cantidad total para 50 μL). Para determinar el grado de pureza de este se determina la relación de absorbancia A260/280 y A260/230. Un valor anormal en esta relación, podría indicar presencia de impurezas que podrían interferir en nuestro estudio.

Obtención de los ovocitos del sapo Xenopus laevis

Xenopus laevis

Para trabajar necesitamos extraer los ovocitos del sapo Xenopus laevis. Estos han de ser criados en acuarios, bien cuidados con higiene, fungicidas y bien alimentados con hígado de cerdo cocido. Todos los sapos han de ser hembras, y al estar todas juntas en un mismo lugar, sincronizan sus ciclos sexuales, e incrementan la producción individual y colectiva de ovocitos.

Extracción de los ovocitos del sapo Xenopus laevis

Seleccionamos al sapo más gordito y saludable, y que no tenga cicatrices de operaciones previas. Lo dormimos en un cubito con tricaina diluida durante media hora, y tras comprobar que no se mueve ni reacciona a estímulos de tacto y presión, procedemos a la operación. Se pone sobre hielo, porque el frío la adormece aún más. Tras esterilizar los materiales con etanol 96%, realizamos un corte semicircular de 0.5 cm en la zona inguinal; primero la epidermis, y luego el músculo. Mientras operamos, tenemos que ir remojando el sapo continuamente, porque se seca y se le cuartea la piel. Tras abrir el orificio, introducimos las pinzas y agarramos el tejido inmediatamente debajo, realizando movimientos circulares y sobre todo, hacia la región anterior y la posterior; y de esta forma va saliendo toda la bolsa donde se hallan los ovocitos. Se hace con cuidado para no dañar los órganos internos del sapo. Tras extraer 6-7 cm. de bolsa, realizamos un corte limpio con las tijeras, y procedemos a dar un par de puntos, con hilo y aguja; primero en el tejido muscular, y luego en la epidermis. Se introduce en un acuario aparte durante una semana, para que se recupere por su cuenta y no esté estresada por los demás sapos hembras. Los sapos producen por la piel una alta cantidad de antibióticos que les protege de infecciones bacterianas o fúngicas, y su capacidad de cicatrización es sorprendentemente rápida. En menos de una semana podrá volver con sus compañeras de acuario, y dentro de unas semanas podríamos volver a operarla (aún le queda el lado derecho sin cicatriz).

Los sapos producen por la piel una alta cantidad de antibióticos que les protege de infecciones bacterianas o fúngicas, y su capacidad de cicatrización es sorprendentemente rápida

La bolsita de ovocitos, la ponemos en una placa de petri con solución ND96 sin calcio. Esta solución isosmótica, tiene la justa concentración de sales para mantener el equilibrio osmótico del ovocito, pero está exenta de calcio porque si lo añadimos, las uniones en el tejido conjuntivo que los envuelven y unen, se ven reforzadas. Nuestra intención es disgregar estas uniones y separar los ovocitos, por tanto, tras disgregar mecánicamente con las pinzas la bolsa de ovocitos, introducimos estos en un “Falcon” (tubo de ensayo de 50 mL) con solución ND96 y enzima colagenasa liofilizada del hongo Clostridium histolyticum. Esta enzima disgrega las uniones de colágeno en el tejido y facilita las labores posteriores. Tras veinte minutos, hacemos varios lavados, y dejamos los ovocitos incubando 16oC con solución ND96 durante cuatro horas, para que se vuelvan más laxas las uniones entre ovocitos.

Ovocitos

Una vez procesados mecánica y enzimáticamente, los desfoliculamos uno a uno, lo cual no es otra cosa que, bajo la lupa y con dos pinzas de punta fina, vamos quitándole el tejido trasparente que los rodea. Es un proceso pesado pero se termina bastante rápido, siempre y cuando los ovocitos estén turgentes, si no, es posible que los “pinchemos” y muchos se rompan y se salga el citoplasma. A medida que vamos desfoliculando, se van poniendo en placas de petri pequeñas con: solución ND96 con calcio, gentamicina (antibiótico para evitar contaminaciones) y piruvato (fuente de energía). Cuando terminamos, se colocan las placas en la incubadora a 16oC para conservarlos en sus condiciones óptimas de temperatura.

Ovocitos en buen estado y mal estado

Los ovocitos de “buen aspecto” muestran dos polos diferenciables (A): el polo vegetal y el polo animal, reconocibles por los colores amarillo-beige, y marrón. Si se muestran manchas blancas, lunares, o decoloración en el polo animal, éste debe descartarse (B).

Cada día, cambiaremos dicha solución, para refrescar las sales, el piruvato y el antibiótico; y de paso eliminaremos los ovocitos que dejan de tener los dos polos diferenciados, o que explotaron y liberaron su citoplasma y sus enzimas en el medio. Los ovocitos de “buen aspecto” muestran dos polos diferenciables (A): el polo vegetal y el polo animal, reconocibles por los colores amarillo-beige, y marrón. Si se muestran manchas blancas, lunares, o decoloración en el polo animal, éste debe descartarse (B).

Autor: Juan de Dios Franco Navarro.

Este artículo apareció en el número 5 de Boletín Drosophila.

 

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